（JACC: Basic toTranslational Science IF=3.7) | 教你如何筛选心脏纤维化生物标志物

2020年1月16日，来自加州大学洛杉矶分校的Reza Ardehali团队在JACC: Basic to Translational Science 发表了题为Cardiac Fibrosis Is Associated With Decreased Circulating Levels of Full-Length CILP in Heart Failure的研究性论文，确定LTBP2、COMP和CILP在小鼠和人类心力衰竭中可能作为心脏纤维化的新标志物，而且心力衰竭患者血清中全长CILP水平显著降低。Ltbp2是LTBP家族的一部分，LTBP家族是TGF-β信号的关键调节因子。Comp和Cilp主要在软骨中，结合特定的细胞外基质蛋白，如胶原。

1. 研究背景

心脏的急性缺血事件，如心肌梗死，或由心脏负荷增加会引起心脏纤维化。心脏纤维化与各种心脏疾病相关，可导致心功能受损、心律失常，最终导致心力衰竭。心肌成纤维细胞( Cardiac fibroblasts，CFBs)是参与心肌纤维化发展的主要细胞。在稳态条件下， CFBs通过调节细胞外基质的产生，来维持心脏结构的完整性。然而，在病理条件下，CFBs被激活，增殖，并分泌过量的细胞外基质蛋白，形成瘢痕组织，诱发心脏硬化，并导致不良重塑。随着世界范围内，心脏病患病率的增加，确定可靠的生物标志物，对无创测量心脏纤维化的存在和进展具有重要价值。

2. 研究内容

1）RNA测序确定生物标记

为了鉴定纤维化心脏中CFBs的分泌蛋白，研究者对雌性C57BL/6J成年小鼠，进行主动脉缩窄手术（transverse aortic constriction，TAC），构建心脏纤维化模型。术后7天分离CFBs，进行了RNA测序，观察纤维化早期基因表达变化。在TAC之后，许多基因在CFBs中有差异表达。TAC小鼠的CFBs显示出，与纤维化相关的各种基因的高表达。从这些基因中，研究者筛选出编码分泌蛋白的基因，然后进一步缩小范围，关注那些在心力衰竭背景下新出现的，并且之前报道过，在细胞外基质的形成和重塑中起作用的蛋白。研究者确定Ltbp2、Comp和Cilp为潜在的候选生物标记。

RNAseq分析（图源JACC）

2）小鼠CFBs细胞，TGF-β处理后基因上调

TGF-β信号通路是CFBs损伤反应的主要组成部分。体外用TGF-β处理成纤维细胞，可激活和诱导培养细胞的增殖，模仿体内反应。为了证实TGF-β信号通路能够刺激，上面鉴定的基因的表达，研究者将未受伤的C57BL/6J小鼠的CFBs，在含或不含TGF-β的培养基中培养72小时，用整个心脏外植体培养分离CFBs。TGF-β处理诱导成纤维化基因，和Ltbp2、Comp和Cilp基因表达激活，通过免疫组化在蛋白水平进一步确认了表达水平增加。这些数据证实，在刺激下CFBs是Ltbp2、Comp和Cilp的细胞来源。

小鼠CFBs体外处理（图源JACC）

3）小鼠TAC模型，基因定位在纤维化区域

虽然TAC手术会诱发纤维化，但也会引起其他心脏的病理变化，如肥厚。为了证实损伤后Ltbp2、Comp和Cilp表达的增加与瘢痕形成有关，研究者分析了Ltbp2、Comp和Cilp在TAC手术小鼠心脏中的解剖位置。

免疫荧光染色显示，三种蛋白在假手术的小鼠心脏中表达极低；在TAC心脏中，Ltbp2、Comp和Cilp表达与成纤维标记Ddr2蛋白和a-SMA蛋白共定位。这表明Ltbp2、Comp和Cilp，通过活化的CFBs表达，并定位于纤维化区域。

小鼠TAC模型（图源JACC）

4）心衰患者循环中全长CILP水平降低

为了证实鉴定的蛋白，是否可以作为心肌纤维化的生物标志物的临床效用，研究者评估它们在人类缺血心肌组织中的表达水平。在公共数据库(GSE46224)中，对缺血性心力衰竭患者心脏组织的RNA测序数据表明，LTBP2、COMP和CILP上调。

接下来，研究者培养人CFBs，并用TGF-β1刺激其体外激活。TGF-β1处理导致人CFBs的形态学改变，并诱导LTBP2、COMP和CILP，以及成纤维细胞激活基因的表达。免疫细胞化学染色进一步证实了这三个基因上调。这些体外培养人类CFBs的结果表明，与从小鼠上获得的数据一样，进一步支持了，这些蛋白成为心脏纤维化的生物标志物的潜力。

人心衰组织（图源JACC）

研究者采用免疫荧光染色法，观察LTBP2、COMP、CILP在心力衰竭患者与健康心脏心肌中的表达。与健康心脏相比，心力衰竭患者(诊断为缺血性心肌病)的心肌组织表现出明显的纤维化。在健康心脏中，研究者观察到心肌中候选标记物无阳性或极少量阳性。然而，病变心脏的切片显示，所有3种蛋白的表达显著增加。这3个蛋白的染色定位在心肌紊乱的区域，表明这些蛋白对纤维化区域的特异性。

在心力衰竭患者心脏上，LTBP2、COMP和CILP(红色)表达显著增加（图源JACC）

除了纤维化心肌内表达增加外，研究者试图确定使用LTBP2、COMP和CILP作为心脏纤维化的新循环生物标志物。研究者观察到LTBP2和COMP的循环水平没有显著差异，然而，心力衰竭患者的血清显示出明显的CILP水平下降。CILP基因编码一种前体蛋白，该蛋白被切割成大约75 kDa的N端片段和大约55 kDa的C端片段。这两个片段被证明可以抑制Smad3的磷酸化，这通常是由活跃的TGF-β1信号促进的。研究者专门使用了一种跨越CILP前体裂解位点的抗体，并进行了Western blotting以确定循环中全长CILP的水平。结果显示，心力衰竭患者循环血清中的全长CILP水平显著降低。

总之，这些数据表明，尽管人类心肌纤维化区，活化成纤维细胞表达高水平的CILP，但与没有心脏纤维化的健康个体相比，循环中CILP水平显著降低。

心衰患者血清中全长CILP下调（图源JACC）

3. 创新点

目前的研究证实了，LTBP2、COMP和CILP在小鼠和人类心力衰竭中都可能作为心脏纤维化的新标志物。最值得注意的是，研究者发现心力衰竭患者血清中全长CILP水平显著降低，这增加了它作为心肌纤维化循环生物标志物的可能性。目前，这些数据可以为使用血清CILP水平作为诊断标志物提供更多的支持。

4. 研究思路

5. 问题

在该研究中，没有测量纤维化发展过程中，患者血清中CILP水平的动态变化，也没有在不同心脏衰竭病因的患者大队列上检测循环中CILP水平。未来包含大量心脏纤维化患者的研究，将对研究CILP水平与疾病进展的相关性至关重要。目前，需要进一步的验证研究，来证实这些标志物的临床应用。

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